Title:
MEASURE PROTEIN CONCENTRATION WITH THE BCA PROTEIN ASSAY
Date: November-2014

Team B01-2014: Ζήσος Μήτρος Μιχάλης Τσουμάκης
Students, Dept of Mechanical Eng, NTUA

Short Abstract:
Our task was to measure the protein concentration of a sample using the BCA Protein Assay

Acknowledgements:
We would like to thank Marina Ioannou and Ioanna Preza for their valuable help on many problems that we faced.

Introduction:
Typical protein assays are used to determine protein concentration by comparing the assay response of a sample to that of a standard whose concentration is known. The assay that we used during our experiments is the BCA Protein Assay which is one of the great workhorses for measuring the protein concentration of a sample.

Σ΄όλα τα πεδία των επιστημών που σχετίζονται με την βιολογία, συνεπώς και στην εμβιομηχανική, είναι απαραίτητη η γνώση της επίδρασης που έχουν οι αλλαγές που κάνουμε σ ένα σύστημα στον αριθμό των πρωτεϊνών. Λόγω αυτής της απαίτησης, αναπτύχθηκαν διάφορες μέθοδοι εκτίμησης του αριθμού των πρωτεϊνών σ’ ένα δείγμα. Η κάθε μέθοδος ακολουθεί εναν δικό της μηχανισμό εντοπισμού πρωτεϊνών, που τις διαφοροποιεί ως προς:

την ευαισθησία, δηλαδή τη δυνατότητά μιας μεθόδου να παρακολουθεί μικρές μεταβολές στην ποσότητα της πρωτεΐνης
Το μέγεθος των δειγμάτων στα οποία μπορεί να διενεργηθεί
Τη δυνατότητα καθαρισμού του διαλύματος από παρεμβάλουσες ουσίες
Την ευαισθησία της σε παρεμβάλλουσες ουσίες (σταθερότητα της μεθόδου)
Το κόστος της μέτρησης
Την μεταβλητότητα των αποτελεσμάτων της

Εμπορικά έχουν κυριαρχήσει 6 βασικές μέθοδοι καθορισμού του πληθυσμού των πρωτεϊνών. Οι 4 πρώτες βασίζονται στον απ’ ευθείας προσδιορισμό των προτεινών ενώ οι υπόλοιπες προσδιορίζουν έμμεσα τις πρωτείνες μέσω του προσδιορισμού των κυττάρων.
Όλες αυτές οι μέθοδοι είναι φασματοφωτομετρικές-χρωματομετρικές, δηλαδή ο προσδιορισμός του αριθμού των πρωτεινών έγινε με μέτρηση της αλλαγής του χρώματος του δειγματος που τις εμπεριέχει λόγω της προσθήκης ενός αντιδραστή (reagent).
Biuret
Η μέθοδος Biuret αποτελεί τη παλιότερη και την λιγότερο ευαίσθητη μετρητική διαδικασία μέσω χρωματομετρίας. Ο μηχανισμός εντοπισμού των προτεινών που μεταβάλλει το χρώμα των δειγμάτων βασίζεται στην αντίδραση των πεπτιδικών δεσμών των πρωτεινών με τον Cu+2, δημιουργώντας ένα σύμπλεγμα με Cu+1 που μεταβάλλει το χρώμα απο μπλέ σε ένα ανοιχτό μωβ χρώμα με μήκος κύματος τα 540nm.

Εικόνα 1:το χρώμα του θετικού Biurettest Εικόνα 2: η βασική αντίδραση του Biurettest

Τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι η εύκολη και γρήγορη διενέργεια της μέτρησης (20 λεπτά επώαση), η εύκολη παρασκευή των αντιδραστών (reagent), και η μικρή ευαισθησία της σε χημικές παρεμβολές απ’ ότι οι άλλες μέθοδοι. Χρησιμοποιείται συνήθως για δείγματα με συγκεντρωση πρωτείνης απο 1-10 mg/ml.
Τα βασικά υλικά και ο εξοπλισμός που απαιτείται είναι

Ένα standrard: 10-20 mg/ml BSA
Ένα ρυθμιστικό διάλυμα (buffer)
Τα δείγματα πρωτεϊνών που θέλουμε να μετρήσουμε
Ο αντιδραστής Biuret
1 φασματοφωτόμετρo

Στο βίντεο που ακολουθεί περιγράφεται η διαδικασία

Ηartree-lowry
Η αρχική μέθοδος του Lowryέγινε το 1951 ωστόσο βελτιώθηκε από τον Hartreeτο 1971 για να μπορέσουμε να διακρίνουμε πως οι παρεμβάλλουσες ουσίες στρεβλώνουν την μέτρηση και πως οι βάσεις διαλυτοποιούν τις αδιάλυτες πρωτεΐνες. Ο μηχανισμός που μεταβάλλει το χρώμα των διαλυμμάτων που περιέχουν πρωτείνες βασίζεται τόσο στην ίδια αντίδραση με το Biurettestόσο και με την οξείδωση των παραμενουσών αρωματικών πρωτεινών. Το χρώμα που προκύπτει είναι μπλε με μήκος κύματος 750nm.

εικόνα 3: τα στάδια του μηχανισμού αλλαγής χρώματος στην μέθοδο Hartee-lowry
Τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου έγκειται στην μεγάλη ευαισθησία, κάτι που φαίνεται και απο το πιο ίντονο χρώμα που παίρνουν τα διαλύμματα των πρωτεινών με τους αντιδραστές, η γραμμική σχέση συγκέντρωσης-απορροφησης για μεγάλο εύρως συγκεντρώσεων (30-40%), η δυνατότητα αποθήκευσης των αντιδραστών για μεγάλο χρονικό διάστημα και η σπάνια δημιουργία ιζημάτων στα διαλύμματα των πρωτεινών-αντιδραστών. Τα δείγματα τα οποία μπορεί να μετρήσει ειναι συγκέντρωσεις απο 10-1000 μg/mlωστοσο χρησιμοποιούνται κυρίως για διαλύματα απο 100-600 μg/ml.
Υλικά

Standard: 300 μg/ml BSA
Ρυθμιστικό διάλυμμα (buffer)
Τα δείγματα που περιέχουν την πρωτείνη
3 αντιδραστές Α,Β,Cτου Hartree-Lowry
Λουτρό νερού 50ο C
1 φασματοφωτόμετρο

Απαιτείται επώαση 10 λεπτά σε λουτρό θερμού νερού 50ο C σε δύο στάδια τις διαδικασίας.

BCA
ToBCAείναι μια μέθοδος που ανακαλύφθηκε από τον Smith, η οποία έχει πολλά συγκριτικά πλεονεκτήματα σε σχέση με την μέθοδο Hartee-lowry. Ο μηχανισμός εντοπισμού των προτεινών βασίζεται σε 2 αντιδράσεις. Αρχικά, οι πεπτιδικοί δεσμοί της προτείνης μειώνουν τα δυσθενή ιοντα χαλκού Cu+2 που βρίσκονται στους αντιδραστές σε μονοσθενή Cu+1 (biurettest). Το ποσοστό του Cu+2 που ελλατώθηκε είναι ανάλογο του αριθμού των προτεινών. Στην συνέχεια 2 μόρια του μόρια του οξέος bicinchonic δεσμεύουν τα ιόντα Cu+1 δημιουργώντας ένα σύμπλεγμα που μετατρέπει το χρώμα από πράσινο σε μωβ χρώμα μήκους κύματος 562 nm.

Eικόνα 4: τα δυο στάδια της αντίδρασης που μεταβάλλει το χρώμα κατα τη μέθοδο BCA

Εικόνα 5: το χαρακτηριστικό χρώμα του BCA
Το BCAείναι ιδιαιτέρως ευμετάβλητο ως προς το χρόνο επώασης, την θερμοκρασία επώασης, και το πρότυπο βαθμονόμησης (standard). Ορισμένες τάξεις ενώσεων όπως αναγωγικά σάκχαρα και ιόντα αμμωνίου παρεμβαίνουν στην μέτρηση, μερικές φορές σοβαρά. Άν όμως οι παρεμβολές απομακρυνθούν η δοκιμή BCAέχει καλό συνδυασμό ευαισθησίας απλότητας. Συγκεκριμένα τα βασικά πλεονεκτήματά του είναι η υψηλή ευαισθησία του (αρκετά μεγαλύτερη του Lowry)και ο εύκολος εντοπισμός τυχόν παρεμβαλλουσών ουσιών ωστόσο είναι ακριβό.

Bradford
Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε απο τον Bradford το 1976. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί μια ειδική βαφή που αλλάζει χρώμα όταν έρχεται σε επαφή με πρωτείνες. Οι χημικές αντιδράσεις που προκαλούν την αλλαγή χρώματος του διαλύματος είναι τελείως διαφορετικές από τις παραπάνω 3 μεθόδους (Biuret,Hartree-Lowry,BCA). Ο εντοπισμός των πρωτεινών γίνεται εφικτός με την αλλαγη του χρώματος σε μπλε μήκους κύματος 595 nm.

Εικόνα 6: σχηματική αναπαράσταση της αντίδρασης εντοπισμού πρωτεινών
Tα βασικά πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι η απλότητα της μεθόδου, η ευαισθησία της σε μια ευρή γκάμα πρωτεινών, (ειναι 2-3 φορές πιο ευθαίσθητο απο τον Lowryκαι BCA) ωστόσο τείνει να μην δημιουργεί ευθείες γραμμές στο standard, οι παρεμβάλλουσες ουσιές ειναι παρα πολύ δύσκολο να εντοπιστούν και αναστέλλεται η λειτουργία του σε βασικό περιβάλλον.
Τα δείγματα στα οποία μπορεί να έχει εφαρμογεί κυμαίνονται απο 150μg/ml.
Υλικά

Standard: 1.5 mg/ml BSA και 1.5 mg/ml λυσοζύμη
Ρυθμιστικό διάλυμμα (buffer)
Τα δείγματα που περιέχουν την πρωτείνη
Coomassie reagent
1 φασματοφωτόμετρο

Στο βίντεο που ακολουθεί περιγράφεται η διαδικασία

Resazurin protocol
Είναι μια μέθοδος προσδιορισμού των βιώσιμών κυττάρων. Ωστοσο χρησιμοποιείται και για των προσδιορισμό του αριθμού των πρωτεινών σε βιώσιμα κύτταρα εφόσον γνωρίζουμε τον μέσο αριθμό πρωτεϊνών που φέρουν τα κύτταρα της καλλιέργειάς μας.
Η ρεσαζουρίνη (resazurin) μπορεί να διαλυθεί σε ένα φυσιολογικό ρυθμιστικό διάλυμα (buffer), αποκτώντας ενα βαθύ μπλέ χρώμα, και να προστεθεί απ ευθείας στα κύτταρα της καλλιέργειας που βρίσκονται σε ομοιογένεια. Τα βιώσιμα κύτταρα με ενεργό μεταβολισμό μετατρέπουν την ρεσαζουρίνη σε ρεσορουφίνη (resorufin), η οποία έχει χρώμα ρόζ και φθορίζον. Μετρώντας την αλλαγή του χρώματος μπορούμε να προσδιορίσουμε τα επίπεδα των κυττάρων, άρα και των πρωτεϊνών.

Εικόνα 7: σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας
Τα βασικά πλεονεκτήματα της είναι ότι είναι σχετικά φθηνή, είναι πιο ευαίσθητή μέθοδος από την ΜΤΤ. Δεν απαιτείται λύση (lysis) των κυττάρων. Το μειονεκτημά της είναι η πιθανότητα φθορίζουσας παρεμβολής απο άλλες ουσίες και ο μεγάλος χρόνος επώασης (1-4 h).
Υλικά

Δείγματα κυττάρων
Επωαστης
Resazurin
1 φασματόμετρο

Στο βίντεο που ακολουθεί περιγράφεται η διαδικασία

MTT
Όπως και το resazurinprotocolείναι μέθοδος προσδιορισμού απ’ ευθείας των βιώσιμων κυττάρων. To ΜΤΤ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) τοποθετείται σένα ρυθμιστικό διάλυμμα και προστίθεται σε κύτταρα σε καλλιέργεια.
Χρησιμοποιείται για δείγματα με συγκέντρωση από 0.2 - 0.5 mg / ml. Απαιτείται επωάση για 1 έως 4 ώρες. Τα κύτταρα με ενεργό μεταβολισμό μετατρέπουν το ΜΤΤ σε αδιάλυτη φορμαζάνη (formazan) η οποία έχει μώβ χρώμα.
Η όλη διαδικασία γίνεται στο σκοτάδι λόγω της ιδιαίτερης ευαισθησίας της ΜΤΤ στο φως. Η ποσότητα φορμαζάνης (που είναι ανάλογη προς τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων) μετράται με καταγραφή της απορρόφηση στα 570 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο.

Εικόνα 8:Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας
Το πλεονέκτημα της μεθόδου είναι το σχετικά μικρό κόστος του, έχει μικρότερο κίνδυνο από παρεμβάλλουσες ουσίες σε σχέση με την resazurin. Τα βασικά μειονεκτήματά της εκτός του ότι απαιτεί επώαση για 1-4 ώρες, είναι ότι είναι πρωτόκολλο μεγαλύτερο από resazurinκαι έχει περιορισμένη ευαισθησία.
Στο βίντεο που ακολουθεί περιγράφεται η διαδικασία

Συγκεντρωτικά τα χαρακτηριστικά της κάθε μεθόδου:

Μέθοδος	Μήκος κύματος	Μηχανισμός	Όρια ανισχευσης (μg/ml)	Πλεονεκτήματα	Μειονεκτήματα
Biuret	550 nm	Biuret,ελλάτωση cu+2	200-2000	γρήγορη,χαμηλού κόστους	Ελάχιστη ευαισθησία, υψηλή μεταβλητότητα
BCA	562 nm	ελλάτωση cu+2, αντίδραση BCAμε Cu1+	20-2000	Συμβατή σε βασικό περιβάλλον,υψηλή ευαισθησία, ευκολος εντοπισμος παρεμβαλλουσών ουσιών	Ακριβό, ευμετάβλητο στους χρόνους και θερμοκρασίες επώασης
Bradford	470 nm	Αντίδραση Coomasie -proteins	20-2000	Απλό, γρήγορο,υψηλή ευαισθησία	Ασύμβατο σε βασικό περιβάλλον,μη γραμμικά αποτελέσματα
Lowry	750 nm	ελλάτωση cu+2, αντίδραση folin-ciocacteuμε Cu1+	10-1000	Υψηλή ευαισθησία,γραμμική σχέση συγκέντρωσης απορροφησης,αποθήκευση αντιδρώντων	Ασύμβατη σε βασικό περιβάλλον, αργή διαδικασία
Resazulin	560 nm	Resazulin-resoluflin	200-500	Φθηνή,υψηλή ευαισθησία, δεν απαιτεί λύση των κυττάρων	Ευαίσθητη σε παρεμβάλλουσες ουσίες,μεγάλος χρόνος επώασης
MTT	570 nm	MTT- Formazan	200-500	Φθηνή, δεν απαιτεί λύση των κυττάρων	Μικρότερη ευαισθησία,μεγάλο προτώκολλο, μεγάλος χρόνος επώασης

Συγκεκριμένα τώρα για τη μέθοδο του BCAΑπαραίτητη ορολογία
Lysis: είναι ένα υγρό το οποίο περιέχει στοιχεία τα οποία σπάνε την κυτταρική μεμβράνη και δημιουργούν κατάλληλο περιβάλλον ώστε να μην αποσυντεθούν οι πρωτεΐνες. Αποτελείται από σαπούνι, PI και PMSF σε κατάλληλη ποσότητα. Το PI (Phosphatase Inhibitor) όπως και το PMSF (PhenylMethaneSulfonylFluoride) είναι αναστολείς φωσφατάσης και πρωτεάσης και αποτελούν απαραίτητα συστατικά των περισσότερων διαδικασιών κυτταρικής λύσης και εκχύλισης πρωτεΐνης. Αυτοί οι αναστολείς μπλοκάρουν ή αδρανοποιούν ένζυμα τα οποία απελευθερώνονται από τα ίδια τα κύτταρα και τα διασπούν.
PBS: (Phosphatebufferedsaline) είναι ένα διάλυμα που σε κυτταρικές καλλιέργειες έχει στόχο να απομακρύνει νεκρά κύτταρα και παρεμβάλλουσες ουσίες που θα επηρέαζαν την ακρίβεια των μετρήσεων. Στη δική μας περίπτωση χρησιμοποιήθηκε για να πραγματοποιηθεί η αραίωση.
BSA: (Bovine Serum Αlbumin) είναι μια ρυθμιστική πρωτεΐνη η οποία προέρχεται από αγελάδες και γνωρίζουμε την συγκέντρωση της.
Buffer: είναι το ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο αποτελείται κατά ¼ Lysisκαι ¾ PBSκαι μας βοηθά να κάνουμε τις απαραίτητες αραιώσεις.
Η διαδικασία που ακολουθήσαμε έτσι ώστε να βρούμε τη συγκέντρωση σε πρωτεΐνη άρα και τον αριθμό των κυττάρων που περιείχε το δείγμα μας (κάνουμε την παραδοχή ότι 1 cell = 0,5 ngprotein) είναι η εξής:

Φτιάξαμε το standardμας με τις αραιώσεις που θέλουμε. Δοκιμάσαμε αραιώσεις με το μισό (2-fold) (1,1/2,1/4,1/8,1/32,1/64 και 1/128) και με το 1/3 (3-fold) δηλαδή ( 2/3,2/9,2/27,2/81 και 2/243). Δημιουργήσαμε τρεις τέτοιες στήλες (στήλη 1, 2 και 3), έτσι ώστε τα αποτελέσματα μας να είναι στατιστικά ασφαλή (triplicates).
Από κάθε wellτων στηλών 1, 2 και 3 πήραμε 10 μl και τα τοποθετήσαμε σε διπλανό well, με αποτέλεσμα να προκύψουν οι στήλες 4, 5 και 6. Αυτό το κάναμε γιατί το workingreagentγια να αντιδράσει βέλτιστα θέλει την συγκεκριμένη ποσότητα.

Έπειτα βάλαμε σε διπλανή στήλη τα δείγματα που θέλουμε να μετρήσουμε και στα οποία στη συνέχεια βάλαμε WR. Η ποσότητα από κάθε δείγματα που βάλαμε ήταν και πάλι 10 μl.

Αναλυτικότερα τώρα η όλη διαδικασία για την περίπτωση 2-foldαραίωσης .
Αρχικά, στο πρώτο well της στήλης 1 τοποθετούμε BSA,Lysisκαι PBSδημιουργώντας έτσι ένα διάλυμα με συγκεκριμένη περιεκτικότητα πρωτεΐνης (1mg/ml). Στη συνέχεια κατά μήκος όλης της στήλης κάνουμε διαδοχικές αραιώσεις του αρχικού διαλύματος προσθέτοντας ίση ποσότητα bufferκαι διαλύματος έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του wellνα είναι η μισή (αραίωση ½).

1) Στο πρώτο well στη στήλη 1 τοποθετούμε BSA, Lysis και PBS δημιουργώντας έτσι ένα διάλυμα με συγκεκριμένη περιεκτικότητα πρωτεΐνης (1mg/ml).
2) Από αυτό το wellπαίρνουμε 10 μLκαι τα τοποθετούμε σε διπλανή στήλη (στήλη 2)
3) Στο δεύτερο wellτης στήλης a κάνουμε αραίωση του από πάνω well κατά 50% μέσω της προσθήκης buffer.
4) Στη συνέχεια επαναλάβουμε τα βήματα (a)και (b) δημιουργώντας αραιώσεις 1/2 ,1/4, 1/8 ,1/32 ,1/64 και 1/128 του αρχικού διαλύματος.
5) Στη στήλη 10 τοποθετήσαμε τα δείγματα και προσθέσαμε PBS έτσι ώστε η συνολική ποσότητα να είναι 10μL (ίδια με των standards).
6) Σε κάθε well της στήλης 4,5,6 και 7 τοποθετήσαμε WRσε ποσότητα 200 μl.
7) Κάναμε επώαση για 30 minσε θερμοκρασία 37oC.
8) Μετρήσαμε την απορροφητικότητα κάθε well.
9) Δημιουργήσαμε καμπύλη σημείων όπου στον y-άξονα αναφέρεται η μέση τιμή της απορροφητικότητας (absorbance) κάθε αραίωσης και στον x-άξονα η συγκέντρωση.
10) Έπειτα, βρήκαμε την εξίσωση της ευθείας (y = ax+b) η οποία περνάει όσο το δυνατόν πιο κοντά από αυτά τα σημεία.
11) Έχοντας το absorbance των δειγμάτων μπορούμε να βρούμε από την παραπάνω εξίσωση την συγκέντρωση τους και έπειτα τη μάζα τους και εν τέλει των αριθμό των κυττάρων.

Για να καθορίσουμε την αρχική ποσότητα BSA που πρέπει να μπει στο πρώτο well καθώς και όλες τις ποσότητες των επιμέρους συστατικών θα πάμε από το τέλος στην αρχή. Ξέρουμε ότι στο τελευταίο wellτης στήλης a με συγκέντρωση 1/32 της αρχικής πρέπει να πάρουμε 10μLκαι να μείνει κάποια ποσότητα. Θέσαμε ότι αυτή η ποσότητα πρέπει να είναι 22 μL. Άρα, αυτό το wellπρέπει να έχει 32 μL. Αυτή η ποσότητα έχει προκύψει από το πάνω wellσυγκέντρωσης 1/16 mg/ml προσθέτοντας 16μL διαλύματος και 16μL buffer. Ομοίως πρέπει να πάρουμε 10 μL και να περισσέψει κάποια ποσότητα .
Με τη παραπάνω διαδικασία υπολογίστηκαν όλα τα wells, καθώς επίσης και οι συνολικές ποσότητες Lysis, WR, bufferκαι των επιμέρους συστατικών τους. Φτάνοντας στο πρώτο wellτελικώς βλέπουμε ότι πρέπει να έχουμε 60μL σε συγκέντρωση 1mg/mlBSA,lysisκαι PBS, τηρώντας την αναλογία 1/4 lysisκαι 3/4 PBS. Το φιαλίδιο BSAέχει συγκέντρωση 2mg/ml άρα θα χρησιμοποιήσουμε 30μlBSA, 60/4=15μLlysisκαι επειδή έχει το BSA από μόνο του PBSθα χρησιμοποιήσουμε 3*60/4=45-30= 15μl επιπλέον PBS.
Ακόμη, σχετικά με τη ποσότητα του Lysisτο οποίο θα χρειαστεί θα είναι το 1/4 του BUFFERπου έχουμε βρει και τα 15 μL που έχουμε παραπάνω. Αν αυτή η ποσότητα προκύψει μικρότερη από 100 μL τότε θα βάλουμε 100 μL. Το lysisθα αποτελείται από x/100 PI, x/50 PMSFκαι το υπόλοιπο θα είναι σαπουνόνερο.
Τέλος, όσον αφορά τη ποσότητα του WRαναφέραμε ότι θα βάλουμε 200 μL σε κάθε wellπου έχουμε sampleκαι standard. Το WRαποτελείται από 2 συστατικά Α και Β. Η ποσότητα Α θα είναι τόση όσο WRβρήκαμε παραπάνω, έστω y. Η ποσότητα του Β θα είναι y/50.

Παρακάτω, παραθέτουμε διάγραμμα το οποίο δείχνει όλες τις αναμείξεις και τις ποσότητες.

Διάγραμμα ποσοτήτων απαραίτητων συστατικών
Αποτελέσματα 3-fold αραίωσης

Από τη μέση τιμή του absorbance κάθε αραίωσης δημιουργείται το παρακάτω διάγραμμα.

1) Βρίσκουμε την εξίσωση ευθείας που συνδέει absorbance - concentration.
2) Γνωρίζοντας το absorbance των δειγμάτων βρίσκουμε τη συγκέντρωση τους.
3) Μάζα δείγματος = Συγκέντρωση x Όγκο
4) Αριθμός κυττάρων = Μάζα δείγματος / 0.5
Παραδοχή: 1 cell = 0.5 ng protein